P450标准化表征⽅法

P450的异源源表达

真核生物P450是膜蛋白，酿酒酵母由于含有内质网膜系统，是真核P450表征的优选底盘。下述操作均以酿酒酵母作为底盘进行介绍。需要给目标蛋白加上6*His等亲和标签，具体条件可以根据实际情况进行调整。

⼀、P450表征底盘细胞的构建： 真核生物（植物和真菌等）P450发挥功能需要P450还原酶传递电子。因此需要将目标物种的P450还原酶或其模式植物的P450还原酶构建在底盘细胞中。利用酿酒酵母GAL10启动子在酿酒酵母多拷贝位点整合P450还原酶作为P450筛选底盘细胞。

⼆、P450构建： 将P450利用酿酒酵母GAL1启动子在P450筛选底盘细胞的其他多拷贝位点整合P450并在C端添加His tag 以检测P450的表达。

三、体内表征： 挑取表达P450的酿酒酵母单克隆接种到装有1ml YPD培养基的试管中，30℃，250rpm，培养24h。在24h向培养基中添加适量浓度底物，30℃，250rpm，培养24h。然后终止反应，萃取底物与产物，对反应进行检测。

四、体外表征：

1、挑取单菌落到50ml 合适SD培养基或YPD培养基上，30°C 250rpm 48h。

2、室温 4000g 5min离心收菌，转接到200ml YPD培养基，培养24h。

3、4℃ 4000g 5min离心收菌，转接到200ml YPD培养基，16°C 110rpm诱导培养24h。

4、酵母诱导培养后，4℃ 4000g 5min离心收集菌体（所有操作在4℃下进行，溶液预冷），弃上清，再离心，吸走残液。10ml buffer A （100mM potassium phosphate buffer，pH 7.4 1mM EDTA 0.5mM DTT 1mM PMSF） 洗一次，去除残液。

5、对酵母菌体进行液氮研磨。待菌体融化之后，加2ml 左右buffer A 重悬，4℃ 10000g离心15min。

6、转移上清至超速离心管，100000g 4℃ 离心1 h。

7、离心后去除上清，用1ml buffer A 重悬微粒体沉淀。

8、取 50ul 微粒体蛋白进行反应，体系300ul buffer B (100mM potassium phosphate buffer，pH 7.4 1mM EDTA)，1mM NADPH，适量底物。在30℃下，混合12h。之后终止反应，萃取产物进行检测。

五、产物提取： 根据底物的理化性质，选择合适的溶剂（如：正丁醇、乙酸乙酯等）从反应体系中萃取反应产物。

六、产物检测： 根据产物的理化性质以及灵敏度，选择合适的检测方法，如HPLC和LC-MS等方法。

七、数据统计： 根据实际结果，计算P450的比酶活以及Km等各种动力学数据，并上传到元件库。